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[转帖]人类种植前胚胎的染色体分析 [复制链接]

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只看楼主 倒序阅读 0  发表于: 2005-07-04

山东省泰安市中心医院妇产科;山东泰安271000 蒋满喜(综述);于新艳(审校)


关键词:染色体异常;荧光原痊杂交;核型分析;种植前


摘要:核型分析是诊断人类胚胎染色体异常的常规方法,但是通过细胞遗传学方法对人类种植前胚胎进行染色体检测并不容易。因此分裂间期细胞核的荧光原位杂交(FISH)就成为首选方法之一。体外受精(IVF)种植前胚胎的FISH和核型分析均表明:胚胎的染色体异常率可高达25%~51%。FISH分析显示染色体异常最常见的情况是染色体嵌合(22%~24%)和胚胎分裂紊乱(7%~26%)。虽然目前还不能应用以上方法对自然受精的胚胎进行检测,但是染色体嵌合以及胚胎分析紊乱较高的发生率可以为我们合理的解释人类的月经周期自然妊娠率为什么如此之低(25%),提供理论今年。


人是哺乳动物中生育能力较差的物种之一。研究表明正常女性的每个月经周期自然妊娠率约为25%,怀孕的前三个月流产易发期。发生自然流产的原因可能有多种,其中包括男性因素、女性因素或胚胎自身因素。众所周知导致胚胎早期丢失的主要原因是染色体异常,怀孕前三个月所发生的自然流产中有50%~70%是染色体异常。


体外受精-胚胎移植(IVF-ET)时经常会发生早期流产。IVF的种植前胚胎丢失率以及生化妊娠率比我们预想的要高。Schlman等人估计大约42%的胚胎在孕7周之前就已经发生流产。对IVF胚胎造成影响的原因一般包括培养条件、激素刺激或者胚胎形成,以及染色体异常等诸多方面,特别是染色体异常可能是造成胚胎早期流产的主导因素。


IVF为人类配子、合子以及种植前胚胎染色体组成的研究提供了便利。种植前胚胎的细胞遗传学研究是人类生殖医学技术的重要组成部分,而且还有助于我们对人类生殖机理的认识。


1、人类种植前胚胎的细胞遗传学分析


人类种植前胚胎染色体组成的分析方法主要有两种:核型分析和原位杂交。 1.1核型分析


核型分析是对人类种植前染色体异常胚胎进行诊断的重要手段。然而对人类种植前染色体异常胚胎进行常规的细胞遗传学检测,同时又具有相当的困难。首先胚胎必须具备继续发育的潜能,而且只能检测分裂中期的细胞核,发育停滞的胚胎不适于核型分析。另外分析染色本条数及带型时还必需进行适当的固定。


人类种植前胚胎染色体组成分析,以往常用的方法是用抗有丝分裂剂处理分裂期的早期胚胎,使其停滞在分裂中期然后过夜培养,接着除去透明带(ZP),分散卵裂球并进行固定。但只有极少数卵裂球处于分裂中期,很难获得最佳的染色体丢失。近来有文献表明这种分析方法的成功率极低(29%),而且无法检测染色体嵌合的情况。


另一种方法是,对胚胎活检获得单个卵裂球用抗有丝分裂剂处理后立即进行过夜培养。Santalo等曾对17个二倍体胚胎进行单个卵裂球活检,染色体制备的成功率可达46%,而且其中有75%的样本可进行染色体分析。但是使用这种方法染色体丢失也是无法避免的问题。对囊胚进行取样检测是最近才发展起来的一种方法。Clouston等人发现81.9%的囊胚可以正常分裂成小的卵裂球,而且大约2/3的中期卵裂球可以进行核型分析。利用人类囊胚核型分析,在胚胎发育早期就可以对胎盘组织的嵌合情况进行检测。


1.2原位杂交


原位杂交是检测单个细胞染色体组成及其数目的有效方法之一。特异性DNA探针可以与固定后的间期或中期染色体发生杂交。该方法适用于那些染色体不易获得的样本诸如种植前胚胎。早期的非放射性原痊染色杂交应用是酶标记法,但是目前酶标记法已经被荧光标记替代,而且荧光标记检测的速度快、特异性强、敏感度较高。染色体荧光原位杂交(FISH)是用荧光染料对DNA探针进行标记。探针类型一般包括:中心粒探针、位点特异性探针及着色探针(painting probe)。中心粒型及位点特异性探针有助于对间期染色体进行结构分析。着色探针适于对中期染色体进行结构分析。多条染色体FISH检测时每个DNA探针都要用不同的荧光染料进行标记。而且FISH检测的缺点是仅仅能够提供有限的染色体信息(由特异性探针的类型及数量而定)。近来有报道认为FISH可以同时检测多达5条以上的不同染色体。光学显微镜核型分析(FISH检测的一种)也可以对大量的间期染色体进行定量分析,而且检测的染色体条带可达10条以上。光学显微镜核分析最大的优点是,几乎所有的胚胎以及90%的卵裂球都可以获得检测结果。


2、人类种植前胚胎的染色体组成


Delhanty等建议对种植前人类胚胎进行细胞遗传学分类,主要分为4类。细胞遗传学分类不但有利于人类种植前胚胎进行染色体分析,而且还适用于核型分析。四种细胞遗传学类型分别为:正常用于核型分析。四种细胞遗传学类型分别为:正常型,同一枚胚胎的所有细胞均正常(二倍体);异常型,同 覆盖胚胎的所有细胞均不正常(所有细胞含有相同的异常染色体);嵌合型,一部分细胞正常,而另一部分细胞异常,同时具有两种细胞类型,紊乱型染色体,同一枚胚胎的细胞之间染色体异常是随机分布的。如果大多数细胞的染色体正常,这种嵌合可称作二倍体嵌事,如果大多数细胞的染色体异常即为异常嵌合。 3、不孕患者种植前胚胎的染色体异常


核型分析表明,正常受精的分裂期胚胎中有25%~40%染色体异常。Harper等人对IVF患者剩余的正常发育胚胎进行FISH检测发现31%染色体异常。虽然单倍体胚胎很少(2%),但是发生嵌合情况的比较严重(22%)。另外,87%的嵌合体为二倍体。仅仅13%为异常嵌合(单倍体或多倍体)。而且值得一提的 这些正常发育的胚胎中还有7%的为紊乱型染色体。


Gianaroli等用FISH方法对不孕患者的未移植胚胎加以研究,发现每个IVF周期的胚胎异常率(%)与IVF失败次数之间存在正相关关系:经地两次IVF均失败的种植前胚胎染色体异常率为54%;三次失败为60%;四次为65%;5次以上的为72%。而Munne等人应用FISH技术对两年内的IVF胚胎分析地表明,不孕患者染色体异常率(/人/周期)之间并无明显差异。因此移植形态良好而染色体异常的胚胎可能是导致着床失败的主要原因。如果前一个IVF周期中染色体异常的情况再次出现,那么那使将来再进行IVF治疗也不会获得令人满意的效果,而且这类患者可以考虑应用其他的助孕(ART)途径(诸如赠卵和供精等)。


3.1有生育能力患者种植前胚胎的染色体异常


对于继发性不孕女性而言,研究其染色体异常可能造成的后果及其作用机理,最为理想的方法是进行染色体组成分析。Delhanty等应用FISH技术,对那些为避免X-性连锁疾病的PGD患者进行大量的研究,检测结果与常规IVF惊人的相似,52%的胚胎染色体异常,染色体紊乱胚胎及嵌合体比例也相当高,分别为26%和24%。而且更令人惊奇的是,所有紊乱型胚胎均未发育停滞或者发育异常。但是其中82%的嵌事型胚胎为二倍体,16%为异常嵌合,仅有2%的胚胎染色体完全异常。生育正常患者种植前胚胎的FISH分析结果表明,染色体嵌合及染色体紊乱的发生率较高。染色体嵌合的发生率较高可能是导致分娩型胎透嵌合以及单亲二体发生的主要原因。


3.2嵌合型的种植前胚胎


单个的早期卵裂球可以产生胚外滋养层和内细胞内(胚胎组织的来源)。但是我们还无法预测嵌事型胚胎中染色体异常细胞空间能够朝什么方向发展,这些细胞即可能会导致时间的生化妊娠,也可能发育成正常的二倍体。胚胎发育正常与否主要是由异常染色体数量、异常细胞的比例或者染色体异常的类型决定的。嵌事型胚胎中染色体正常的细胞能够将异常的胚胎细胞自动转化为胚外滋养层,这种现象我们称之为"分娩型胎盘嵌合"。但是合子(受精卵)分裂错误造成的胎儿三体发生率相当高,也从另一个侧面表明并不是所有的异常细胞都能够转化为胚外滋养层。而且即使丢失部分胚胎细胞(例如胚胎冷冻和复苏)也能够出生发育成正常的胎儿。因此,如果能够控制异常细胞的分化,少部分细胞异常并不会真正影响嵌合胚胎的正常发育。


多倍体经常发生于许多动物的滋养层组织(包括人在内)。早期胚胎中出现多倍体可能是胚胎细胞发生分化的标志。而且实际情况下,7.1%的形成和发育正常的胚胎会产生四倍体,而是二倍体/四倍体形成的嵌合体。人类桑葚胚和囊胚FISH分析表明,31%的桑葚胚以及29%囊胚具有5个以上的多倍体细胞,与动物囊胚研究结果比较一致。最近Clouston等对人类囊胚进行了核型分析,10%为四倍体,而且其中23%为二倍体/四倍体形成的嵌合体。2/3的单倍体胚胎是二倍体/单倍体的嵌合体,而且明显正常的胚胎也可能含有一个三倍体细胞。


3.3紊乱型染色体


胚胎染色体发生紊乱可能与患者自身条件有关:一部分患者多个连续周期中出现紊乱型胚胎,而有些患者却从来不会产生。似乎暗示暗示某些女性自身易于产生染色体不稳定的胚胎,而且极有可能是由遗传因素决定的,但是目前还无法对此作出合理解释。由于染色体紊乱型胚胎无法正常着床,因此也可能是导致IVF失败的重要原因。这就表明胚胎形态正常而多次IVF失败可能主要是由染色体异常造成的,移植这种类型的胚胎无疑会导致着床失败或者早期流产。


4、染色体异常与胚胎形态


核型分析表明,染色体正常或异常的胚胎形态及其发育速度之间无显著差异。虽然形态正常胚胎染色体也可能异常(36.6%),但是形态异常的胚胎其染色体异常率较高(86.6%)。Zenzes等对两组IVF(妊娠组与未获妊娠组)未移植胚胎的染色体状态进行了一系列研究。研究显示同龄IVF患者中,获得妊娠组的染色体正常率显著高于未获妊娠组。表明对移植前胚胎进行染色体分析有助于提高妊娠率。


Delhanty等用FISH技术研究了胚胎形态与染色体组成之间的关系,研究发现形态优良胚胎(Ⅰ级)的染色体异常率为31%,中等(Ⅱ级)和低质量(Ⅲ级)的胚胎分别为58%和52%,中等与低质量胚胎的染色体异常率相差不大。因此如果不进行FISH检测,往往会将染色体异常胚胎当作正常胚胎进行移植。而且染色体异常的胚胎经常会发生染色体(套)紊乱的现象:中等质量胚胎发生率为40%,而低质量胚胎为77%。


另外一种比较常见的形态异常就是多核。胚胎发育到2~3天时出现多核现象是染色体发生异常的突出表现(74%),一般为染色体紊乱或者多倍体。但是如果形态正常胚胎发育至第4天出现了一个以上的多核细胞,那么其染色体往往是正常的。因此发育至第2天是多核出现与否的关键阶段。 4.1染色体异常与异常受精


FISH还能够为异常受精胚胎的染色体组成分析提供一定的技术支持。多精受精胚胎通常为三倍体或异常嵌合体。ICSI获得三原核胚胎一般为三倍体或者三倍嵌合体。常规IVF和ICSI获得的单原核而分裂正常的大部分胚胎染色体通常为正常二倍体。对这种现象的第一种解释为:两个原核可能已经发生了融合;第二种解释为;卵子已经被注入精子激活但是精子自身未形成原核。


4.2染色体异常与女性年龄


FISH技术也可以对患者年龄与种植前胚胎的染色体组成之间存在的关系进行研究。众所周知。年龄较大的女性容易出生三体型胎儿,25~29岁之间的女性与29~35岁的患者对比,三体型胎儿出生率由19%上升为19.1%,差异不显著。25~39岁年龄组与40~45岁年龄组妊娠女性中,第18、13和21条常染色体的非整倍体发生率由1.3%上升为4.3%24~34岁与35~39岁年龄组中,分裂期性染色体X、Y及常染色体18、13和21的非整倍体发生率分别为5.4%和10.3%。如果只检测发育正常的胚胎,非整倍体的发生率相差更大,20~34岁年龄组为4%,而40~45%岁年龄组则上升为73.2%。因此IVF胚胎非整倍体发生率之间的差异可能表明,在诊断是否临床妊娠之前,大多数非整倍体胚胎就已经被淘汰(自然选择)。临床实践表明,大多数可正常发育到8细胞的非整倍体胚胎与流产率之间并不存在任何可比性。根本原因可能是,只有发育到4~8细胞,胚胎基因组活性才能被激活,而且非整倍体胚胎造成的不良影响只有到了妊娠后期才能够表现出现。而且形态正常的非整倍体胚胎随着年龄的增加而增加。


由于大约50%的IVF女性患者年龄超过34岁,因此曾经人有建议IVF治疗时必须利用FISH技术对非整倍体胚胎进行检测。FISH检测可能有多种优点,特别是能够检测非整倍体所导致的着床率下降的情况。通过移植染色体正常的胚胎能够提高率,而且自然流产和三体型发生率也明显减少。尽管目前全世界范围内,已经能够通过卵裂球活检和极体活检技术对非整倍体胚胎进行检测,但是其具体优点还没有得到证实。而且胚胎着床率能否增加也未得到难证,但是活检/PGD的确能够使自然流产率显著下降。


5、结论


FISH和核型分析均发现,IVF种植前胚胎的染色体异常发生率高达25%~51%,其中以染色体嵌合(22%~24%)和染色体紊乱(7%~26%)为主。因此人类种植前胚胎的染色体分析可能表明,自然选择是导致IVF着床率较低的根本原因。尽管目前还无法对自然受孕过程中的胚胎进行类似的检测,但是如果能够将胚胎染色体嵌合以及分裂紊乱高频率发生的情况与自然受精进行对照的话,那么就可以对人类生育能力较低这一重量现象作为合理的解释。

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学习了
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只看该作者 2  发表于: 2012-02-21
既深奥又现实,人类这是怎么了•••
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