近几年来，随着细胞分子生物学技术、显微外科技术、计算机技术等的迅速发展，对男性不育症的诊断手段也日新月异，新的诊断技术如荧光原位杂交、化学发光分析、免疫组织细胞化学、核酸分子杂交、各种PCR技术等，新的仪器设备如计算机辅助精液分析(CASA)、PCR仪、流式细胞仪等不断涌现和改进，使对男性不育机制的认识更加深刻、全面，亦为男性不育的诊断和治疗打开了新的一页。
一、精液常规分析
20年前，国内绝大多数实验室只开展精液常规分析，它是对男性生育力的最初也是最基本的评判。当时，在普通光学显微镜下见到活动精子大于50％、活力达到Ⅲ级以上且精子密度>60X106／ml，就认为可以生育。这样的分析主观性很大，而且对生育力的判断很不准确。目前对精液常规分析多行CASA，评判的参数更细更广。CASA是利用录象机或摄象机和计算机视屏技术产生的新技术，可通过录象机或摄象机与显微镜连接，确定和跟踪个体精子细胞的活动，并将所获得的电子信号输入计算机，通过分析给出各种参数，从而对精子密度、活率、活力及形态有较为客观细致的了解。Verstegen等证实，不同的CASA仪器用不同的精子分类方法皆有较高的精确性和可信度，可作为客观评估不同国家、地区及不同人种精子质量差异的工具。
Guzick等对9个单位的765例不育和696例生育男性进行了精液常规分析，认为亚临床性不育男性的诊断标准应为：精子密度<13．5X106／ml、活率<32％，用严格标准的精子正常形态<9％。Andrade-Rocha等研究了233例不育男性不同精液参数之间的关系，发现精子活力、正常头形精子数比例与精子密度直接相关，而无定形头、尖头、逐渐变细及复合缺陷精子比例与精子密度负相关，大头精子在>40X106/ml的精液中最高，精子中段缺陷在<10X106/ml的精液中最低，而影响男性生育精子异常可见于任何精子密度水平，这提示精子任何异常的增加都是男性生育率低下的可能原因。
二、生精细胞的检测与睾丸活检
精液中除成熟的精子外，亦可见未成熟的生精细胞，包括精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、早期和晚期精子细胞等。目前，生精细胞的检查已成为男性不育症的常规检查，最常用、最简便的方法是瑞-姬染色法，但其要求较高，检验人员必须掌握一定的细胞学基础知识和技术。荧光原位杂交技术、单克隆抗体的免疫细胞化学技术、流式细胞仪等也常被使用，但因其需特定的仪器设备，使其难以常规开展。
生精细胞的检查主要用于诊断无精子症，以区分阻塞性无精子症和非阻塞性无精子症，亦可判断非阻塞性无精子症病人的生精细胞阻滞阶段。非阻塞性无精子症的发生与生精细胞的凋亡密切相关，因而对生精细胞凋亡的检测亦倍受重视。生精细胞凋亡的检测可用染色法，此法简便实用，显微镜下凋亡生精细胞核染色质固缩、核周聚集，呈境界分明的新月形或块状小体，即凋亡小体。亦可用试剂盒检测，目前常用的为TUNEL法，即末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧核苷酸原位末端标记法，但其操作繁琐，不宜常规使用。最近，王光荣等用FITC-AnnenixV／PI荧光染色结合流式细胞术(FCM)检测了正常生育和不育男性精液中精子凋亡情况，生育组的凋亡率明显低于不育组，且凋亡率与精子密度、精子前向运动率及精子正常形态率呈显著负相关。FCM是集激光、计算机、半导体、统计学等技术于一体的高科技技术。FCM除用于检测生精细胞凋亡外，还可应用于：①精子细胞增殖周期定量分析，由此可获得精液或睾丸组织中各类细胞的相对比例的精确数据及精子形态学等指标，对精子发生障碍的性质和程度作出客观精确的评价，尤其对少精子症和无精子症的诊断及疗效预后有明显优点，可替代睾丸活检，减少病人痛苦。②用FITC标记的花生凝集素可检测顶体结构完整性，而人精子顶体结构与精子活率、活力成正相关。③可用于精子染色体核型、抗精子抗体及癌前病变的检测。④利用FCM能在复杂的细胞群中测定每一个细胞大小、胞质内颗粒的多少、DNA及RNA含量、细胞表面标志、胞膜上及胞质内受体、细胞蛋白质及酶的质和量等多种参数。FCM具有快速、准确、客观、可靠等优点，可反映精液的整体状况，具有广阔的应用前景。
尽管生精细胞的检查可部分替代睾丸活检，但睾丸活检仍有其优势。第一，睾丸活检可对病人的精子发生有更全面的了解。Jamal等对过去10年进行了睾丸活检的164例病人进行了分析，发现27％的病人有正常精子发生，其中15％与输精管梗阻有关；25％的病人精子发生低下；24％的病人有伴随间质纤维化的末端精曲小管硬化；16.5％的病人有生殖细胞发育不全，仅有局部精子发生；7％的病人精子成熟阻滞，仅1例与核型异常相关。第二，对输精管、射精管阻塞性无精子症病人，往往需行睾丸活检。尽管阻塞性与非阻塞性无精子症病人的一些指征有所不同，如FSH>7．6 mIU／ml、睾丸长轴<4．6cm的病人，应认为属非阻塞性无精子症；精液量减少、第二性征正常、激素水平正常、睾丸正常者，认为阻塞性无精子症的可能性较大，但这些指征并不绝对。第三，睾丸活检可检测淀粉样变
性、睾丸肿瘤等。研究显示，淀粉样变性病人和睾丸肿瘤病人往往伴随不育。此外，睾丸活检对睾丸组织学诊断亦有指导作用。
现代的睾丸活检技术倾向于用细针穿刺，常用的为睾丸精子抽吸术(TESA)、睾丸细针抽吸细胞学(FNAC)技术，其损伤比睾丸活检要小。Westlander等对35例无精子症行TESA，并对其后遗症进行了调查，除1例有诊断性睾丸血肿、4例术后有严重不适外，未见TESA对血清FSH、T、抗精子抗体阳性率及睾丸大小的影响，认为其是一安全有效的方法。Rosenlund等LlMJ分别用16和14号针行睾丸活检，结果两者的组织学结果基本一致，除1例有轻度疼痛和局部轻度肿胀外，没有术后并发症，提示两者同等可信。
无精子症病人常常在睾丸中仅存在一些精子发生灶。为了获得准确的诊断或俘获精子以供辅助生育技术应用，往往需在双侧睾丸几个任意位置进行多次活检以寻找精子，这将不可避免地对睾丸造成损伤。最近，Eytan等建立了以高能多普勒超声(PDUS)为基础的睾丸活检技术，睾丸PDUS在7个横断面获得了三维图象以确定精子最可能存在的优先区，以预言最可能的精子发生部位，从而减少了对睾丸的损伤。
三、白细胞精子症的检测
白细胞精子症常见于感染、自身免疫性疾病、吸烟、酗酒、脊髓损伤(SCl)等病人的精液中.世界卫生组织(WHO)规定，精液白细胞数>1X106／ml，可诊断为白细胞精子症。然而，存在的问题是，削弱生育力的最低白细胞水平应是多少?Sharma等对白细胞计数和氧化应激(OS)之间的关系进行了研究，发现OS发生于很低水平的精液白细胞者(0～1X106／m1)，并随白细胞数增加而增加，提示，安全的最低白细胞数并不能被确定，任何白细胞的存在都与OS有关，并因此削弱生育力。
白细胞可通过吞噬作用、产生活性氧(ROS)、分泌一些细胞因子等途径使精子损伤。精液中粒细胞为产生ROS的主要细胞。Rajesh等探讨了氧化剂前体物的氧化应激作用，亚致死剂量的氧化剂前体物诱导了明显的睾丸和附睾精子OS，脂质过氧化作用显著增加，睾丸组织DNA损伤显著增加，异常精子头增加2～3倍，生育力明显降低。因此，对OS的检测亦是反映白细胞精子症的一个指标。目前检测OS的最常用的方法为依赖鲁米诺的化学发光分析法。Kobayashi等对此法进行了系统的评价，结果显示不同时间分析间的差异、同一检测者之间的差异、不同检测者之间的差异在统计学上皆无显著意义，ROS水平随着样本放置时间的延长而降低，1小时后显著降低，3小时后降为1小时的32％。ROS水平随精子密度增加而呈线性增加，提示此法是精确可信的，而且此法亦可对白细胞数目进行检测。
对精液中白细胞的检测还可用下列方法：①直接镜检法。通常先将精液细胞沉淀涂片，然后用瑞-姬染色或巴氏染色法染色。此法简便易行，但有时与生精细胞难以区分。②过氧化物酶染色法，常用的有正甲苯胺蓝、联苯胺及邻甲苯胺过氧化物酶染色法，由于其依赖于内源性过氧化物酶，故受细胞成熟度及涂片技术等影响。③荧光原位杂交法。可根据杂交信号的数目和位置，结合细胞核特有的形态对白细胞进行鉴定。④免疫细胞化学法。即根据白细胞表面标志，用抗白细胞及其亚群的单克隆抗体结合酶标记进行反应，此为目前检测白细胞的最可靠的方法，但操作复杂，试剂昂贵，而且因其灵敏度高，阳性率也相应提高，故诊断标准亦应作相应修改。⑤弹性蛋白酶、IL-8及溶菌酶测定法。研究显示，它们均与精液白细胞数呈正相关。
四、免疫性不育的检测
男性精子具有抗原性，对男性而言可引起抗精子的自身免疫反应，而对女性而言可致抗精子的同种免疫反应。在生理情况下，由于血睾屏障的存在、精浆免疫抑制物和生殖道免疫活性细胞的作用，可抑制男性产生抗精子抗体(AsAb)。但在以上作用机制发生异常时，可产生AsAb，从而可在不育男性血清和精浆中检出AsAb，血清中主要为IgG和IgM型AsAb，而精浆中主要为IgA型，亦可见IgG和IgE。AsAb可通过妨碍精子正常发生、干扰精子获能和顶体反应、凝集和制动精子、影响精卵结合、干扰胚胎着床和影响胚胎存活等多种机制使男性生育力降低。
目前，检测AsAb的方法主要有：精子凝集反应、放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、免疫印迹法、精子制动试验、酶免疫分析(EIA)等，尤以ELISA法应用最为广泛，抗精子抗体的ELISA检测法已成为临床常规检验。
然而，目前用于临床AsAb检测的包被抗原基本为精子膜抗原，检测的相应AsAb就为总的抗精子膜抗原的抗体，而精子膜与人体其他器官组织的细胞膜有许多共同抗原，因而这种抗原抗体反应的特异性不高。如用针对精子或睾丸特异性抗原，或针对与透明带识别和结合有关的抗原作为包被抗原来检测AsAb，其临床意义就会很大。Naz用现代分子生物学技术确定，受精抗原FA-1和YLP(12)具有此特性，并且它们的抗体存在于不育男性的精浆和血清中，建立这种特异诊断方法是今后取代总AsAb检测的唯一途径。
五、生殖道感染的检测
现已报道，大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、绿脓杆菌、淋球菌、肺炎克雷伯氏菌、结核杆菌、衣原体、支原体、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒、腺相关病毒、阴道毛滴虫等皆可感染生殖道，而且可致不育。各种细菌感染，往往通过菌体本身及其释放出的毒素、酶类等影。向精子质量，例如，大肠杆菌菌毛的粘附可使精子凝集，其中的孔蛋白和弹性蛋白酶对精子具有毒性；大肠杆菌、链球菌、绿脓杆菌等产生的毒素可引起精子制动；细菌感染可消耗果糖，影响精子的能量代谢；更重要的是，细菌感染可引起炎症反应，导致精液白细胞升高，而白细胞对精子质量的影响更为广泛，尤其是其氧化应激对精子的损害。
病毒的感染更为隐蔽。Eries等对73例少弱精子症病人和22例正常精液标本用PCR法对腺相关病毒(AAV)DNA进行了检测，前者阳性率为38％，后者为4．6％；而AAV辅助病毒、人巨细胞病毒和乳头瘤病毒DNA在两者有类似的阳性率。在睾丸组织中，38例活检标本有10例检出AAVDNA，8例睾丸切除标本中2例检出AAVDNA，提示异常精液AAV感染率明显增加，睾丸AAVDNA的检出提示AAV可能通过干扰精子发育而影响男性生育二目前，临床实验室多用ELISA法检测各种病毒的抗体，通过抗体的分型可粗略判断病毒的感染时期。
衣原体和支原体感染被认为是最常见的性传播疾病(STD)病原，并且其感染率有逐年上升的趋势。与男性不育密切相关的衣原体为沙眼衣原体(CT)，其可引起急性附睾炎和慢性前列腺炎等。目前，检测沙眼衣原体感染的方法主要有金标法、ELISA法及培养法，尤其ELISA法最为常用，但其阳性率较高。Tokuda等报道，83例男性不育病人中血清抗CT-IgG为12％，抗CT-IgA为19．3％，且阳性者精液白细胞数明显增加，而精液量和精子数反而减少。Bollmann等用血清学方法并用特异DNA检测证实，834例病人中3％一5％的人检出衣原体特异DNA，而用属特异性ELISA法检出38％的IgA抗体，用种特异性ELISA法检出8％～22％的IgA抗体，且部分病人显示精子质量降低及紊乱的男性附属性腺功能。
与男性不育密切相关的支原体为解脲支原体，其可吸附于精子表面，摄取宿主细胞内的营养物质，进行代谢并蓄积毒性产物，产生的ROS可直接对精子膜产生损伤，从而影响精子功能。目前，临床实验室多采用培养法检测。
六、精浆细胞因子的检测
精浆细胞因子由男性泌尿生殖道内的各种细胞分泌，包括转化生长因子(TGF)、表皮生长因子(EGF)、肿瘤坏死因子(TNF)、各种白细胞介素(IL)及某些可溶性受体等。目前认为，与男性不育有关的细胞因子主要有IL-6和IL-8，不育病人精浆中IL-6和IL-8水平明显高于生育力正常的男性。测定IL-6和IL-8的方法有：生物学方法、分子生物学方法和免疫学方法，以免疫学方法多用，尤以ELISA和RIA常用。
七、精浆生化的检测
精浆中的一些生化标志可反映男性附属性腺、附睾及睾丸生精功能等，有利于综合评价不育的发病原因和机制。例如，柠檬酸、锌、镁、谷氨酰转肽酶和酸性磷酸酶可反映前列腺功能，其中的酸性磷酸酶检测已成为男科实验室的常规检查，常用磷酸苯二钠法；果糖与前列腺素可反映精囊腺功能，常用间苯二酚法检测果糖；游离左旋肉毒碱、甘油磷酸胆碱和。-葡糖苷酶可反映附睾功能，Yassa等对精浆r葡糖苷酶与精液其他参数进行了比较，结果显示r葡糖苷酶与精子前向活率和精子受精能力成正相关，并认为在正常精子浓度和血清雄激素水平的个体中有诊断价值。
抑制素B被认为是男性精子发生的血清标志物。成年男性血清中维持可检测的抑制素B水平需要生精细胞的存在，生精功能低下与生精阻滞男性血清抑制素B水平显著低于正常生精功能的男性，唯支持细胞综合征(SCO)男性血清抑制素B水平极低。Brugo-Olmedo等认为血清抑制素B在预言非阻塞性无精子症病人的睾丸精子存在时比血清FSH更准确。除此之外，抑制素B还可用于儿童隐睾、性早熟的诊断，监测放、化疗对男性生精功能的损伤等。目前，抑制素B的检测通常使用双抗体夹心ELISA法。
最近，Hallak等研究了51例少精子症病人的精子悬液的肌酸激酶(CK)水平，他们发现少精子症病人CK水平明显高于生育组，而严重少精子症病人(精子密度<5X106／m1)CK水平显著升高，比中、轻度少精子症者高18倍，尤以精索静脉曲张原因的病人为高，提示CK可作为精子质量和成熟的敏感指标，CK升高的水平与异常功能精子增加率和胞浆潴留增加有关。
八、精子发生相关基因的检测
与精子发生相关的基因很多，目前研究较多的有：DAZ、YRRM、DYS、TSPY、CREM、HSP70-2等。DAZl编码对精子发生必需的RNA结合蛋白，DAZl的缺陷可影响精子形成，存在的生殖细胞仅为精原细胞和少量精母细胞。Schrans-Stassen等的研究表明，DAZl缺陷鼠的精原细胞缺乏是由于Aal精原细胞不能分化为A1精原细胞。无精子症和严重少精子症病人DAZ的缺失率达18.2％~31.6％。最近，deVries等发现，不育男性病人的严重性与DAZ基因拷贝数亦密切相关。
YRRM基因主要在生殖细胞表达，特别局限于精原细胞和初级精母细胞，无精子症病人往往YRRMl和YRRM2皆缺失，而日本人和中国人则无YRRM2基因；DYS基因中，DYSl和DYS240的缺失率可达11％；TSPY基因、CREM基因的缺失和突变皆可导致生精缺陷；HSP70-2基因表达于正常和成熟阻滞的精母细胞和精子细胞，而唯支持细胞综合征病人缺乏，提示其与精子发生密切相关。
最近，Hellsten等研究发现Ⅱ型多磷酸肌醇5-磷酸酶(1npp5b)基因缺乏鼠，不仅其精子活率和与卵受精的能力明显降低，而且可致受精素B的加工受阻；囊性纤维化跨膜传导调节基因(CFTR)突变及5T等位基因的DNA变异与囊性纤维化(CF)病人的无精子症有关；电压依赖性离子通道蛋白(VDAC)基因缺乏亦可致男性不育，尽管精子数正常，但精子活率明显降低。
这些基因的检测与多种分子生物学技术有关，最基本的技术为多聚酶联反应(PCR)技术，据此又发展了多种以PCR为基础的技术，如多重PCR，可对多个基因的缺失同时检测；定量PCR技术，可对某种基因的表达进行相对定量，以研究基因表达的剂量效应；PCR-SSCP技术，可检测某些基因的突变。另外，mRNA差异显示技术，可用于筛选某些特定阶段表达的特异基因；核酸序列分析技术，可对基因突变和缺失直接检测；斑点印迹杂交技术，可用于基因突变和基因定位的检测。
九、遗传学检测
男性不育的遗传学检测主要是检测精子染色体的异常。常规使用染色体显带技术，如G带、Q带等技术，然而其敏感度不及FISH技术，Huang等用FISH技术检测出数种G带无法检出的异常核型，FISH可用于研究复杂染色体突变如性染色体异常、未知的小标志物、环状染色体、嵌合体及易位等。Ryu等引用电子显微定位仪对严格形态学标准正常的精子进行FISH检测，以确定X、Y、18染色体的不分离发生率，结果显示不育组的非整倍体发生率明显高于生育组，提示正常形态学不能作为判断遗传学正常的绝对指标，而且ICSI失败的原因可能部分归于选择了这些非整倍体精子。Carrell等报告，圆头精子增加的不育病人，其精子非整倍体率增加。即使用圆头精子行ICSI获得了后代，但非整倍体亦可见于其后代。Rubio等用双色或三色FISH技术检测了63例不育男性精子非整倍体率及双倍体发生率，其显
著高于生育者，尤以少弱畸精子症病人为高，且具有异常FISH结果的夫妇妊娠率明显降低，说明其与精子染色体异常增加有关，尤以性染色体、13、18、21号染色体的异常为多见。Frydman等用双色FISH技术检测了6例不育者的(13：14)和(14：21)罗氏易位的发生率，两者的发生率类似，且均显著高于生育对照组，提示其与不育有关，并且要求在ICSI前应做此类遗传学检查。
Y染色体长臂特异区的微缺失与不育相关，但是，大多数特发性无精子症和少精子症病人Y染色体大体上是完整的，这可能与Y染色体上一些基因的重排或Y染色体上非重组区上顺序的变异有关。无精子和少精子症病人中10％一15％有AZF区的微缺失。Calogero等报告1例AZF区微缺失病人，其首次睾丸活检证实为精母细胞成熟阻滞，然而，一年后此病人生精上皮发生明显的自发性退化，睾丸活检示极小部分(10％)为精原细胞成熟阻滞，余为唯支持细胞综合征表现，Johnsen得分明显降低。
十、结论
男性不育为最常见的且可鉴定的人类生育失败的原因之一。尽管对精子生理学和精子与配子相互作用的生物学过程的研究已取得很大进展，各种各样的检测方法层出不穷，但目前更多的工作应着重于确定那些预言精子特征十分准确、与配子受精能力密切相关的临床男科诊断实验，并应对这些实验的客观性进行评价，这些实验应简便、经济实用、并提供一致的结果，而且应对它们标准化。
南京军区南京总医院生殖遗传研究室 (南京 210002) 黄宇烽
摘自《中国男科学杂志》
