《中国实验血液学杂志》2009年第6期
（本文作者：中国医学科学院、北京协和医学院血液学研究所 赵海丰等）
微小RNA分子(micro RNA, miRNA)是非编码的RNA分子(noncoding RNA, ncRNA), 对真核细胞的基因表达、细胞发育分化和个体发育等多方面起调控作用。微小RNA作为一种主要的小RNA,是近几年继siRNA研究之后的热点之一。
微小RNA(microRNA, miRNA)是一类长度为约21nt的非编码小RNA。当前研究表明, miRNA基因由RNA聚合酶Ⅱ或聚合酶Ⅲ, 在细胞核内转录成初级转录物(pri-miRNA),后经Drosha酶剪切形成约70nt的miRNA前体(pre-miRNA),在核输出蛋白-5(exprotin-5)的作用下转移至细胞质中, 最后在切酶(dicer)作用下产生成熟的miRNA。成熟的miRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA induced silencing complex, RISC)结合, 通过与靶mRNA的特定序列互补或不完全互补结合,诱导靶mRNA剪切或者阻止其翻译。miRNA基因具有前体折叠形成茎环或类似茎环的二级结构的特点,以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中,而且绝大部分定位于基因间隔区,其转录独立于其他基因,并不翻译成蛋白质,且在相近或多物种中具有保守性。MicroRNA的主要功能是调节与个体生长、发育、疾病发生过程相关基因的表达,在生物发育过程中发挥着包括早期发育、细胞分化、细胞凋亡、肿瘤生成等多方面的重要作用, 研究miRNA的表达, 尤其对其功能研究, 对探索生物进化及防治人类疾病具有重要意义。
miRNA基因表达水平的检测
基因克隆
大多数现有的miRNA是通过cDNA克隆识别和鉴定出来的,这是发现miRNA的重要方法。构建miRNA的cDNA文库通常有两种方法,一种是将所有的RNA通过变性聚丙烯酰氨凝胶电泳分离回收25nt以下的小片段RNA, 随后在RNA3′和5′端连上接头,逆转录后与对应引物进行PCR扩增, 再将片段克隆至载体,最后对每个克隆进行测序。第二种方法是分离出小片段RNA后,用poly(A)聚合酶在3′端进行多聚腺苷酸化反应, 逆转录后, 再在cDNA3′端进行鸟苷酸化反应, 随后进行扩增和测序, 最后通过PAGE/Northern blot等予以验证。
MicroRNA 芯片
MiRNA的研究首先着眼于不同生物样品中的表达有差异的miRNA。为检测样品中各个miRNA的表达水平, 高通量的芯片检测为首选方法。由于miRNA片段小,而且miRNA分子间差别有可能是一个碱基,所以对芯片要求高。芯片检测的前提是首先分离得到具有高质量的、一定丰度的小RNA组分。为了达到这一目的, 通常需要采用专用的miRNA提取盒进行抽提。因为一般的抽提RNA方法会丢失200nt以下的小RNA。miRNA芯片的优点是高产出、高灵敏度、高特异性、但价 格昂贵,结果可重复性差。
Northern blot
最为经典的RNA检测方法是Northern blot,也是研究miRNA的重要方法。它不仅具有高灵敏的特点,而且能结合使用RNA marker检测小RNA的分子大小。Northern杂交作为miRNA 定量的方法,只需将已知浓度梯度的寡核苷酸对照物与待测样品进行平行杂交即可。实验步骤简单, 主要包括:先分离总RNA,通过琼脂糖凝胶电泳分离RNA后,将其转移至固相支持物上,然后与探针分子杂交;最后对特异结合的探针分子的图像进行分析。Northern blot是检测miRNA s的可靠方法, 缺点是所需样品量大,可测范围小,存在一定的错配杂交等问题。
实时定量PCR
实时定量PCR能检测miRNA的表达量, 尤其是在使用Taqman探针法时特异性高。基本操作步骤是先提取miRNA,后与引物混合, 再经过变性, 复性,使引物与模板配对, 然后加入逆转录酶, RNA酶抑制剂, dNTP等反转录为cDNA, 最后以cDNA为模板,进行RT-PCR. 该方法具有高灵敏度、高特异性、样品需量低(可检测到总量低至纳克级的样品)及测量范围宽等优点,缺点是价格昂贵。
其它检测方法
除了上述常用的检测miRNA表达的方法外, 其它还有如液相芯片技术, 原位杂交, Small-target quantitative PCR技术等等。这些方法大多可高效、特异的对miRNA进行定性、定量分析。
miRNA功能研究的检测
识别与鉴定miRNA, 除研究其表达外, 重要的是要对miRNA的功能进行研究。当前研究某基因的功能,我们通常会选用干扰-抑制表达和转染-过表达的正反两方面来研究。对于miRNA功能研究, 我们同样采用抑制miRNA 表达和过表达两方面来研究。抑制miRNA 表达通常有两种方法, 一种是使用2′2氧甲基化修饰的反义寡核苷酸抑制剂,以阻断小RNA的作用; 另一种特定的抑制剂来敲除miRNA的活性, 例如AB公司的Anti-miRTM miRNA inhib itors是序列特异的、经化学修饰以专一靶向和敲除特定miRNA的分子。对于miRNA过表达的研究, 类似于常规mRNA的功能研究, 方法有两种,一种是扩增小RNA基因并将其克隆入逆转录病毒或腺病毒载体, 然后感染目的细胞来研究;另一种是直接合成前体小RNA,如AB公司的pre-miRTM miRNA precersor molecules, 它可以直接进入miRNA加工途径,增强特定miRNA的活性。
本文简要地介绍了常用的几种miRNA检测相关方法。在实际研究中, 我们通常结合使用上述方法。例如我们通过miRNA芯片高通量的筛选出预测miRNA,然后通过real-time PCR和Northern blot以验证目标miRNA。选定目标miRNA后, 通过基于生物信息学建立起来的预测miRNA靶基因的数据库,进一步筛选出miRNA的目标靶基因,最后通过抑制目标miRNA表达和过表达以研究对靶基因的调控作用。总之,随着对miRNA的深入研究, 更为精确、可行、方便的检测方法将不断涌现, 实验者可根据具体条件进行合理选择检测方法。
